Proteinaz K: özellikleri, enzimatik aktivite ve uygulamaları
Proteinaz K, serin proteazlar grubuna ait bir enzimdir, yani aktif katalitik merkezinde bir amino asit serinine sahiptir ve hidrolizle peptit bağlarını kırma fonksiyonuna sahiptir. Bu enzim, sırasıyla, subtilisin proteinleri ailesine aittir (peptidaz S8).
Proteinaz K'nın molekül ağırlığı (MW) 28.900 daltondur ve ilk kez 1974'te, daha önce Tritirachium albümü Limber olarak bilinen mantar Engyodontium albümünün ekstraktlarından izole edildi .
Saçta bulunan keratini parçalayabildiği gösterilen yüksek bir proteolitik kapasite sunar. İngilizce'deki keratin kelimesi "keratin" olarak yazılmıştır, dolayısıyla "proteinaz K" olarak adlandırılmıştır.
Doğal proteinleri parçalama kapasitesinden dolayı, bu enzim çeşitli moleküler biyoloji tekniklerinde faydalıdır. Genel olarak, yüksek molekül ağırlıklı (MW) nükleik asitleri izole etmek ve hazırlamak için kullanılır.
Proteinaz K, proteinleri yok ederken ve RNazları ve DNazları etkisiz hale getirirken nükleer DNA'yı serbest bırakarak etki eder, yani DNA ve RNA preparatlarındaki nükleazları ortadan kaldırır.
Öte yandan, proteinaz K'nın, prion proteinlerinin (PrP C) çalışmasında kullanımı için araştırmacıların ilgisini çeken bazı denatüre doğal proteinleri hidrolize edebileceği görülmüştür.
Bununla birlikte, yüksek proteolitik potansiyeline rağmen, proteinaz K'nın etkisine dirençli proteinler vardır. Bunlar arasında, bulaşıcı süngerimsi ensefalopati ile bağlantılı prionlar (PrP Sc) olarak adlandırılan bazı anormal proteinler vardır.
Proteinaz K'nın özellikleri
Proteinaz K, üç kattan oluşan üçüncül bir yapıya sahiptir ve iki sarmal katının arasına serpiştirilmiş yedi zincirli β yaprağa sahiptir. S8 peptidaz familyasına ait olduğu için, aktif bölgesinde, sıralı sırasını (Asp, His ve Ser) diğer katalitik üçlü familyalardan ayıran bir katalitik triad ile karakterize edilir.
Serin proteaz grubundan bu enzim, alifatik ve aromatik amino asitlerin karboksilik grubuna yakın peptit bağlarının hidrolize edilmesi ile karakterize edilir.
Öte yandan, proteinlerin denatürasyonuna yardımcı olmak için kullanılan ve doğal yapılarını yitirmelerine yardımcı olmak için kullanılan sodyum dodesil sülfat (SDS), Tris-HCL ve EDTA gibi bazı aşındırıcı maddelerin varlığında etkili olabilir.
Bu, elektroforez tekniği için proteinlerin hazırlanmasında ön bir adımdır. Proteinaz K'nin etki gösterdiği pH aralığı oldukça geniştir (2.0 ila 12.0), pH 7.5 ila 12.0 arasındadır ve izoelektrik noktası 8.9'dur. Görülebileceği gibi, çok geniş bir pH aralığına karşı aktiftir.
K proteinazında öne çıkan bir diğer özellik, yüksek sıcaklıklardaki (50 - 60 ° C) mevcudiyetindeki kararlılığıdır.
Enzimatik aktivite
Proteinaz K, kalsiyum iyonu varlığına ihtiyaç duyar, ancak kararlılığını korumak için gerekliyse, bunun aktivitesini etkilemez.
Proteinaz K'nın substratın tamamen sindirilmesini gerçekleştirmesi için yaklaşık 5 dakika ila 2 saat arasında yaklaşık bir temas süresi gereklidir.
Bununla birlikte, bu anlamda Daza ve diğerleri, proteinaz K'nın çeşitli maruz kalma zamanlarında elde edilen DNA'nın saflığını karşılaştırmış ve uzun süreli bir inkübasyonun (24 saate kadar) DNA kalitesini önemli ölçüde arttırdığı sonucuna varmıştır.
Şimdi, farklı protokollerde proteinaz K enziminin kullanılan konsantrasyonuyla ilgili olarak, çok çeşitli olduğu söylenebilir.
Çok düşük konsantrasyonlardan (5 μg / ml) 500 μg / ml konsantrasyonlarına kadar kullanılabilir. Ancak en sık yapılan iş konsantrasyonları, özellikle protein sindirimi ve nükleaz inaktivasyonu için 50-100μg / ml arasında değişmektedir. Her ne kadar 2 mg / ml konsantrasyona rağmen doku tedavisi için gereklidir.
uygulamaları
Uygulamaları çok geniştir ve aşağıda özetlenebilir:
-Tatilleme, PK-SDS, setil-trimetil amonyum bromür (CTAB), modifiye potasyum asetat ve sodyum iyodür ile ekstraksiyon gibi proteinlerin sindiriminde ve DNA ekstraksiyonunda kullanılır.
-Nükleazların etkisizleştirilmesi (RNazlar ve DNazlar).
- İstenmeyen proteinleri elimine etmenin yanı sıra, nükleik asidin salınmasına yardımcı olmak için in situ hibridizasyon tekniğinde (HIS).
-Proteinlerin modifikasyonu.
-Çalışmalarda araştırma düzeyinde, çeşitli çalışmalarda.
K proteinazının avantajları
Proteinaz K kullanan DNA ekstraksiyon teknikleri arasında, bazıları onu kullanmayan diğerleri ile karşılaştırmalı birçok çalışma yapılmıştır ve bunların tümü, enzimi kullanırken daha büyük faydalar olduğu sonucuna varmıştır. Avantajlar arasında aşağıdakilerden bahsedilebilir:
- Yüksek moleküler ağırlıklı, yüksek kalitede ve saflıkta DNA elde edilir.
-Ayrılan DNA 3 aya kadar stabildir.
Ekstre edilen DNA aşağıdaki tekniklerde kullanılabilir: Southern blot, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), elektroforez, diğerleri.
Proteinaz K'ya dayanıklı proteinler
Bazı araştırmalar, prionların (anormal PrPSc toksik proteinleri), PrPC proteinlerinden (doğal) ayrıldığını, çünkü proteinaz K'nın etkisine dirençli olduklarından, PrPC'nin etkilerine karşı duyarlı olduklarına karar vermiştir.
Diğer yazarlar, PrPSc'nin yapısında, hassas kısımların ve proteinaz K'ya dirençli başkalarının olduğunu tarif etmişlerdir. Bununla birlikte, her iki kısım da eşit derecede toksik ve enfektiftir.
Öte yandan, 1987’de Bastian ve ortakları, bir Spiroplasma mirum türünden 4, 28, 30, 66 ve 76 kda protein izole ettiler . Hepsi proteinaz K'nın etkisine karşı dirençliydi ve bazı prionlarla çapraz reaksiyona sokuldu.
Bu türün katarakta ve önemli nörolojik hasara neden olabileceği ve Bastian'ın bilimsel bulguları nedeniyle, diğer araştırmaların yanı sıra, bu mikroorganizmayı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati ile ilişkilendirmek için bir girişimde bulunulduğu bilinmektedir.
Bununla birlikte, bu dejeneratif nörolojik patolojinin etiyolojisi hala prionlara bağlanmaktadır.
Bu anlamda, Butler ve 1991'deki ortak çalışanlar, iki Mycoplasma hyorhinis suşundan 40 Kda proteinaz dirençli bir protein sınıfı tanımlamış ve karakterize etmiştir. Bu patojen domuzları etkiler, dokularını enfekte eder, ancak bu durumda test edilen prionlarla çapraz reaksiyon yoktu.
Bu konuda pek çok bilinmeyeni aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç var.
