Katalaz testi: temel, teknik ve kullanımları
Katalaz testi, bakteriyoloji laboratuvarlarında katalaz enziminin varlığa sahip olduğunu göstermek için kullanılan bir metodolojidir. Gram renklendirme ile birlikte yeni izole edilmiş mikroorganizmalar üzerinde yapılması gereken ana testler. Bu testler, mikrobiyoloğu, söz konusu mikroorganizmanın kesin tanımlanması için izlenecek adımlar konusunda yönlendirir.
Genel olarak, sitokrom içeren bakteriler katalaz enzimine sahiptir, yani aerobik ve fakültatif anaerobik bakteriler buna sahip olmalıdır. Bununla birlikte, fakültatif anaerobik mikroorganizmaların katalaz enzimine sahip olmamasına rağmen, Streptococcus gibi istisnalar vardır.
Katalaz testi esas olarak Streptococaceae (katalaz negatif) ailesinin Staphylococaceae ve Micrococaceae (her ikisi de katalaz pozitif) ailelerini ayırt etmek için kullanılır.
Benzer şekilde, Bacillus cinsi (katalaz pozitif), diğerleri arasında Clostridium (katalaz negatif) cinsinden ayırt edilir.
vakıf
Katalaz, bir hidroperoksidaz olarak sınıflandırılan bir enzimdir, bu, substrat olarak hidrojen peroksit (H202) kullandıkları anlamına gelir.
Aynı zamanda bir oksidoredüktaz olarak kabul edilir, çünkü reaksiyonda elektron verici (indirgeyici madde) olarak görev yapan bir element ve bir elektron reseptörü (oksidan madde) olarak görev yapan bir element vardır.
Katalaz dört üç değerlikli demir atomuna (Fe +++) sahip bir protez grubu içeren bir proteindir, bu nedenle bir homoproteindir. Ferrik iyon, reaksiyon sırasında okside kalır.
Katalazın detoksifiye edici bir enzim olduğu söylenebilir, çünkü fonksiyonu bakteriyel metabolizma sırasında üretilen ve bakterilere toksik olan maddeleri ortadan kaldırmaktır. Bu maddeler arasında hidrojen peroksit bulunur.
Hidrojen peroksit, şekerlerin aerobik yolla ayrışmasından oluşur. Bu işlem aşağıdaki gibi gerçekleşir:
Süperoksit iyonu ( 02 -) (serbest radikal), glikozun aerobik yolla asimilasyonunun nihai ürünü olarak oluşturulur. Bu toksiktir ve onu gaz halinde oksijen ve hidrojen peroksit haline dönüştüren süperoksit enzim dismutaz tarafından elimine edilir.
Hidrojen peroksit ayrıca bakterilere toksiktir ve yok edilmesi gerekir. Katalaz enzimi su ve oksijende hidrojen peroksit açığa çıkarır.
Katalaz, alkoller, aldehitler, asitler, aromatik aminler ve fenoller gibi hidrojen peroksit dışındaki substratlar üzerinde etkili olabilir. Bununla birlikte, hidrojen peroksit ayrıca metil ve etil alkol gibi diğer toksik bileşikleri oksitlemek için katalaz tarafından da kullanılabilir.
Aynı şekilde, fagositik hücrelerde katalaz bulunur ve onu hidrojen peroksitin toksik etkisinden korur.
Katalaz testi için rutin teknik
-Proje yöntemi
malzemeler
% 3 hidrojen peroksit (10 hacim).
Kayar cam
Tek kullanımlık plastik sap veya tahta çubuk.
süreç
Nereden geldiği agara dokunmadan çalışmak için yeterli koloni alın. Koloninin taze, yani 18 ila 24 saatlik bir kültürden olması gerekir.
Koloniyi kuru slayta yerleştirin ve üzerine% 3'lük bir hidrojen peroksit damlası ekleyin (% 30 H202 de kullanılabilir). Kabarcıkların serbest bırakılıp bırakılmadığını derhal gözlemleyin.
yorumlama
Olumlu reaksiyon: kabarcık oluşumu ile kanıtlanan gaz oluşumu (güçlü kabarcıklanma).
Olumsuz tepki: kabarcık oluşumu yoktur.
- Saf kültürde direkt yöntem
Kan içermeyen plakalarda veya takozlarda (tercihen besleyici agar) saf bir kültür üzerine 1 ml% 3 H202 koyun. Kabarcık oluşumunun hemen var olup olmadığını gözlemleyin. H 2 02'yi% 30'da da kullanabilirsiniz.
Nesne taşıma yöntemi ile aynı şekilde yorumlanır.
-Kılcal tüp veya Fung ve Petrishko ile metod
Kılcallık ile% 3 hidrojen peroksit ile 20 mm yükseklikte 67 mm'lik bir kapiler tüpü doldurun.
% 3 H 2 O 2 ile doldurulmuş kılcal ile çalışmak istediğiniz izole koloniye dokunun . Kılcalın yaklaşık 10 saniye içerisinde kabarcıklarla dolup dolmadığını gözlemleyin. Bu yöntem, reaksiyonun haçlar halinde yarı-nicelenmesine izin verir:
Haçlar olmadan kabarcık olmaz (negatif reaksiyon).
+ ---- Küçük kabarcıklar (zayıf veya gecikmiş reaksiyon).
++ Bol kabarcıklar (orta reaksiyon).
+++ - Kabarcıklar karşı uç noktasına ulaşır (enerjik reaksiyon).
Şüpheli veren katalaz testleri için -Taylor ve Achanzar yöntemi
Temiz, kuru bir slayt üzerine izole bir koloni yerleştirin, ardından% 0.5 H202 damlasına koyun ve bir lamel ile örtün. Kapana kısılmış baloncuk oluşup oluşmadığını gözlemleyin.
Yorum: kabarcıkların varlığı pozitif reaksiyonu gösterir. Baloncuklar olmadan negatif reaksiyon olarak yorumlanır.
Mycobacterium türleri için Katalaz testi
Bu tekniğin, pH ve sıcaklık kontrol edilerek yapılması gerekiyor. Farklı Mycobacterium türlerinin kullanımı tehlikeli olduğu için laminer bir akış başlığı altında çalıştırılmalıdır.
-Materials
Hidrojen peroksit% 30 veya 110 hacimde (süperojen).
PH 7 fosfat tamponu
% 10 Tween 80
Mycobacterium wedge 3 ila 4 hafta ekimi
-Reaktiflerin hazırlanması
PH 7 fosfat tamponu
pişmanlık:
1.361 g susuz monopotasyum fosfat (KH2P04).
1.420 g susuz disodyum (Na2HP03) fosfat.
Her iki tuzu da az miktarda saf damıtılmış suda çözün ve 1000 ml'ye kadar suyla tamamlayın.
% 10 Tween 80
Ticari olarak konsantre hale gelen Tween 80'e 1:10 dilüsyon yapın, bu nedenle aşağıdaki adımları izleyin:
1 ml Tween 80 alın ve biraz damıtılmış suya koyun, eritin ve sonra hacmi 10 ml'ye kadar su ile tamamlayın.
Son reaktif
Fosfat tamponunu bir miktar% 10 Tween 80 miktarıyla (eşit parçalarda) karıştırın. Laboratuarda ne kadar hazırlamak istediğinizi tanımlayın.
-a prosedür
Vidalı kapaklı (Bakalit) steril bir test tüpüne 5 ml fosfat tamponu yerleştirin.
Bir aşılama döngüsü ile, takozlara ekilmiş bir Mycobacterium büyümesi için yeterli koloni alın ve fosfat tamponunda çözün.
İpliği fazla sıkmadan boruyu kapatın. Su banyosuna 68 ° C'de 20-30 dakika yerleştirin. Sökün ve 22-25 ° C'de soğumaya bırakın
Nihai reaktifin (karışım) 0.5 ml'sini ölçün ve soğuk solüsyonla tüpe ekleyin. Kabarcık oluşumuna dikkat edin.
Önceki teknikler gibi yorumlanır.
kullanım
Zenginleştirilmiş ortamlarda koloni büyümesi elde edildiğinde, elde edilen koloniler üzerinde bir Gram boyası ve bir katalaz testi yapılmalıdır. Bu, mikrobiyoloğa kesin tanımlama için izlenecek prosedürler hakkında rehberlik edecektir.
Kalite kontrol
Hidrojen peroksit reaktifinin düzgün çalışıp çalışmadığını değerlendirmek için, pozitif kontrol olarak Staphylococcus aureus ve Streptococcus sp'nin negatif kontrol olarak suşları gibi yeni kültürlenmiş kontrol türleri kullanın.
Pozitif kontrol görevi gören diğer bir alternatif kan agarı üzerine bir damla hidrojen peroksit koymaktır, eritrositler katalaz içerir, bu nedenle, eğer reaktif iyi durumda ise kabarcıklı olacaktır.
Bir çikolata agarı negatif kontrol olarak kullanılabilir, burada eritrositler zaten parçalanır ve test negatiftir.
sınırlamaları
- Test için eski kültürleri kullanmayın, aksi takdirde yanlış negatiflere neden olabilirsiniz.
- Agara dokunmamaya özen gösterilmesi durumunda, kan agarı içindeki kültürlerden kolonileri almaktan kaçının; eritrositler katalaz içerdiğinden, bu prosedür yanlış pozitiflere neden olabilir.
-Platin kulplu koloni alırsanız işlem sırasını tersine çevirmeyin, aksi takdirde yanlış pozitifler oluşabilir. Bunun nedeni, platinin hidrojen peroksit ile reaksiyona girip kabarcıklı olmasına neden olmasıdır.
-Reaktif çok kararsız ve zamanla ayrışmaya meyilli olduğundan, çok eskiyse hidrojen peroksit reaktifini kullanmayın.
-Hidrojen peroksit reaktifini hasar görmemesi için ışıktan ve soğutmadan koruyun.
- Her kullanıldığında hidrojen peroksit reaktifinin kalite kontrolünü yapın.
- Eğer H202% 30 oranında kullanılırsa, reaksiyonların% 3 H202 ile yapılanlardan daha güçlü olduğunu göz önünde bulundurun.
